Реферат на тему:


Воспользуйтесь поиском к примеру Реферат        Грубый поиск Точный поиск






Загрузка...
Общая характеристика работы

Национальная Академия Наук Украины

Институт биологии клетки

Русин Ирина Богдановна

УДК 556.31 + 57: 012.4 + 017.7 + 052 + 086.3 + 577. 121

Регуляция гомеостаза микротилець дрожжей рода Сandida

03.00.07 - микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Львов - 2004

Актуальность темы

Работа выполнена на кафедре микробиологии биологического факультета Львовского национального университета имени Ивана Франко Министерства образования и науки Украины

Научный руководитель: кандидат биологических наук, профессор Гудзь Степан

Петрович, Львовский национальный университет имени Ивана

Франко, заведующий кафедрой микробиологии

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Сологуб Леонид Ильич

Институт биологии животных НАН Украины, заведующий лабораторией

обмена веществ;

кандидат биологических наук Бабич Татьяна Викторовна, Институт

микробиологии и вирусологии им. Д. К. Заболотного НАН Украины,

младший научный сотрудник отдела физиологии

промысловых организмов

Ведущая организация: Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко

кафедра микробиологии и общей иммунологии

Защита состоится "11" июня 2004 в 1600 часов на заседании диссертационного совета Д 35.246.01 по защите кандидатских диссертаций при Институте биологии клетки НАН Украины по адресу: 79005, г.. Львов, ул. Драгоманова, 14/16

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биологии клетки НАН Украины по адресу: 79005, г.. Львов, ул. Драгоманова, 14/16.

Автореферат разослан "6" мая 2004

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор биологических наук Федорович Д.В.

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Изучение индукции биогенеза микротилець, катаболитнои рэпРеси их образования, а также деградации пероксисом при утилизации различных углеродных соединений дрожжами имеет как прикладную, так и научную ценность. Процессы недостаточно исследованными. Исследование регуляции гомеостаза микротилець у дрожжей имеет важное значение для ряда биотехнологических и медицинских разработок. Поскольку пероксисомы присутствуют практически во всех эукариотических клетках, дрожжевые пероксисомы используют как удобную модель для изучения функционирования пероксисом человека, что важно для преодоления многих тяжелых заболеваний, д связанных с повреждением гомеостаза пероксисом, в частности, синдрома Зельвегер [Van den Bosch et al., 1992 ].

Исследование гомеостаза пероксисом, являющихся местом локализации многих ферментных систем, и ферментативный содержание которых регулируется в ответ к изменениям окружающей среды, изучение усвоения различных углеродных субстратов дрожжами играет важную роль для получения препаратов ферментов. Изучение гомеостаза пероксисом дрожжей имеет также важное практическое значение для разработки способов повышения накопления этанола в аэробных условиях при утилизации лактозы, является промышленным отходом, лактозозасвоючимы Кребтри-положительными дрожжами C. kefir. При использовании мутантов с поврежденными биогенезом и деградацией пероксисом для сбраживание лактозы можно получить повышенный выход этанола.

Поскольку функционирование пероксисом обеспечивает способность дрожжевых клеток утилизировать много различных субстратов, в том числе соединений, загрязняющих окружающую среду, изучение утилизации различных углеродных источников питания и процессов регуляции гомеостаза микротилець дрожжами при усвоения этих соединений имеет важное значение для разработки биологических методов очистки окружающей среды . Важной проблемой современности является поиск эффективных способов очистки окружающей среды от различных загрязнителей, а в частности, нефтезагрязненных, характеризующиеся токсичностью, длительным расписанию и занимают одно из основных мест среди всех загрязнений [Миронов, 1985; Израэль и соавт., 1986; Фединяк и соавт., 2001; Смирнова_Ефстифеева и соавт., 2002]. Эффективными методами очистки окружающей среды от токсичных соединений являются биологические, основанные на использовании биодеструктивнои способности микроорганизмов. Многие работы последних лет присв кипяченой поиска активных микроорганизмов-деструкторов углеводородных компонентов нефти для очистки загрязненной окружающей среды среди бактерий. В частности, это работы по разработке систем очистки окружающей среды с использованием клеток бактерий Bacillus megaterium 1BD, Pseudomonas fluorescens 1-D биовар ИИ, Basillus subtilis 2-D и др. [Думанская, 1995; Стабникова и соавт., 1995]. Утилизация дрожжами углеводородных компонентов нефти, и в частности неочищенной нефти, недостаточно изученной. Поэтому поиск дрожжевых штаммов-деструкторов представляет значительный интерес. Применение дрожжей перспективен в разв язанни данной проблемы благодаря их биодеструктивний способности и, в частности, пероксисомальному расщеплении углеводородов нефти. Пероксисомы дрожжей, кроме участия в расщеплении многих углеводородных составляющих нефти и нефтепродуктов, участвуют в катаболизме также других углеродных и азотных соединений-загрязнителей.

Св Связь работы с научными программами, планами, темами. Диссертационная работа является частью комплексно-тематических исследований кафедры микробиологии и лаборатории электронной микроскопии биологического факультета Львовского национального университета имени Ивана Франко: БГ-12 Б "Разработка способов утилизации молочной сыворотки ухода молочной промышленности рекомбинантными штаммами пекарских дрожжей с целью получения этилового спирта и белково-витаминных препаратов ", INTAS 99-00788" Principles of peroxisome biogenesis and degradation in yeast ".

Цель и задачи исследования. Целью работы было исследовать образования микротилець и некоторые другие регуляторные механизмы их гомеостаза при утилизации различных источников углеродного питания дрожжами C. kefir ВКМ В-209, а также изучить биодеструкТорн потенциал дрожжей рода Сandida, что базируется на основе пероксисомного расщепление углеводородов неочищенной нефти, выбрать активные штаммы-деструкторы нефти, которые могут быть применены для очистки окружающей среды.

Задачи исследования были следующие.

1) Исследовать усвоения дрожжами C. kefir ВКМ В-209 различных источников углеродного питания от традиционных этанола и лактозы в таких несвойственных как для лактозозасвоюючих дрожжей субстратов: этиламина, олеата и углеводородов неочищенной нефти.

2) Продемонстрировать формирования пероксисом и некоторые другие регуляторные механизмы их гомеостаза при утилизации различных углеродных источников в дрожжей C. kefir ВКМ В-209.

3) Изучить утилизацию углеводородов неочищенной нефти дрожжами рода Candida

4) Для участие пероксисом в процессах биодеструкции углеводородов нефти дрожжами рода Candida.

5) Выбрать активные штаммы-деструкторы углеводородов неочищенной нефти среди дрожжей рода Candida по признакам роста в нефтяном середовиши, степенью деструкции углеводородных составляющих нефти и шириной спектра их утилизации.

Об Объектом исследования в диссертационной работе были: микротельца клеток дрожжей рода Candida.

Предметом исследования в диссертационной работе были: процессы биогенеза, функционирования и деградации микротилець при утилизации различных углеродных источников дрожжами рода Candida.

Методы исследования. Для достижения цели работы использовались микробиологические, биохимические, спектрофотометрические, электронно методы исследований, а также проводилась статистическая обработка результатов.

Научная новизна полученных результатов. Впервые показано утилизацию дрожжами C. kefir ВКМ В-209 таких несвойственных субстратов для лактозозасвоюючих дрожжей как этиламина, олеата, углеводородов неочищенной нефти. Впервые подобраны оптимальные условия для усвоения этих соединений дрожжами C. kefir ВКМ В-209. Высказано предположение о причине слабого усвоения олеата а, возможно, также других ненасыщенныхх жирных кислот в качестве единственного источника углерода дрожжами C. kefir ВКМ В-209. С выяснено путь катаболизма этанола, образованного при утилизации лактозы, в этих дрожжей.

Впервые показано индукцию биогенеза микротилець во время роста в среде с лактозой, этанолом, этиламин, олеатом и углеводородами неочищенной нефти у дрожжей C. kefir ВКМ В-209. Впервые продемонстрировано наличие неполной глюкозно катаболитнои репрессии биогенеза пероксисом у дрожжей C. kefir ВКМ В-209 во время утилизации лактозы. В условиях дефицита кислорода во время утилизации лактозы и этанола как отдельных субстратов питания впервые показано неселективные автофагийну деградацию микротилець у дрожжей C. kefir ВКМ В-209.

Показано способность различных видов и штаммов дрожжей рода Candida использовать углеводороды неочищенной нефти как единственный источник углерода. Исследованы особенности утилизации природного комплекса ароматических, циклических, других углеводородных составляющих неочищенной нефти этими дрожжами. Высказано предположение о возможных причинах воздействию высоких концентраций нефти на снижение роста различных штаммов дрожжей.

В результате исследований биодеструктивнои способности дрожжей рода Candida отобрано 4 активных штаммы-деструкторы углеводородов неочищенной нефти: C. rhagii ВКМ В-1520, C. robusta ВКМ В-1093, C. gropengiesseri ВКМ В-737 C. lipolytica ВКМ В -917. Впервые предложено использовать комплекс четырех активных штаммов-деструкторов углеводородов неочищенной нефти дрожжей C. gropengiesseri ВКМ В-737 C. lipolytica ВКМ В-917, C. rhagii ВКМ В-1520, C. robusta ВКМ В-1093, характеризующиеся взаимодополняющей деструкцией углеводородов нефти, для очистки окружающей среды от нефтезагрязненных.

Впервые показано участие пероксисом в процессе биодеструкции углеводородов нефти штаммов C. rhagii ВКМ В-1520, C. robusta ВКМ В-1093, C. gropengiesseri ВКМ В-737 C. lipolytica ВКМ В-917. Полученными результатами ультраструктурного анализа иллюстрировано и подтверждено предложенную в литературе возможной схеме транспорта н-алкАнов в клетку (поры, каналы эндоплазматический ретикулум), и транспортировки продуктов их первичного окисления в клетке. Высказано предположение о такой же путь поступления в клетку ароматических углеводородов (фенилалканив и некоторых ароматических углеводородов с несколькими бензольного кольца), а также миграции продуктов окисления фенилалканив в клетке. Высказан ряд причин различной деструктивной способности исследованных штаммов рода Candida.

Практическое значение полученных результатов. Исследование процессов утилизации различных субстратов, регуляции гомеостаза пероксисом во время усвоения различных углеродных источников питания дрожжами имеет важное значение для разработки биологических методов очистки окружающей среды, базирующиеся на основе пероксисомного расщепления загрязняющих его соединений.

Отобранные 4 активные штаммы-деструкторы углеводородов неочищенной нефти: C. rhagii ВКМ В-1520, C. robusta ВКМ В-1093, C. gropengiesseri ВКМ В-737 C. lipolytica ВКМ В-917 являются перспективными в использовании с целью очистки окружающей среды от загрязнений нефтью и нефтепродуктов. Штаммы-деструкторы отмечаются повышенным выходом биомассы в среде с нефтью, высокой степенью разрушения совокупности всех рассмотренных углеводородов нефти в целом, а также, широким спектром утилизации отдельных углеводородных составляющих нефти, в том числе таких, которые трудно разрушаются микроорганизмами. Штаммы C. rhagii ВКМ В-1520, C. robusta ВКМ В-1093, характеризуются активным разрушением ароматических углеводородов, штамм C. gropengiesseri ВКМ В-737 отмечается интенсивной деструкцией метано-нафтеновых углеводородов, штамм C. lipolytica ВКМ В-917 характеризуется высокой степенью деструкции н-алканов. Штаммы-деструкторы можно зафиксировать с целью создания биотехнологической системы для очистки окружающей среды от загрязнений нефтью и нефтепродуктами. Благодаря взаимодополняющим нефте-деструкторним свойствам четырех штаммов впервые предложено использовать их в комплексе.

Применение биотехнологический системы, созданной на основе комплекса иммобилизованных клеток выбранных активных штаммов-деструкторов дрожжей рода Candida: C. gropengiesseri ВКМ В-737 C. lipolytica ВКМ В-917, C. rhagii ВКМ В-1520, C. robusta ВКМ В-1093, осуществляющих биодеструкцию загрязняющих окружающую среду нефтяных токсикогенных соединений является перспективным в решении проблемы нефтезагрязненных. Использование этих клеток дрожжей, способных к биодеструкции компонентов нефти, среди которых канцерогенные соединения, позволит снизить токсическое воздействие нефтезагрязненных окружающей среды на человека и живые организмы в целом.

Личный вклад соискателя. Диссертант является непосредственным исполнителем всей екпериментально части диссертационной работы. Соискателем самостоятельно обработано большое количество отечественной и иностранной литературы по теме выполняемых исследований. Автором самостоятельно избран методы исследований, проведены эксперименты и получены экспериментальные данные. Электронно-микроскопические исследования ультраструктуры клеток проведен в сотрудничестве с к.б.н., с.н.с. А.Р. Кулачковская. Определение спектра и степени утилизации углеводородов нефти проведено в спиввпраци с сотрудниками Украинского государственного геологоразведочного института и работниками кафедры органической химии химического факультета Львовского национального университета имени Ивана Франко. Планирование опытов, представленных в 3.1 и 3.2 пунктах результатов, розбробку некоторых рабочих гипотез, интерпретацию части результатов исследований проведено совместно с научным руководителем к.б.н., проф. С.П. Гудзем и к.б.н., м.н.с. А.Н. Мороз.

Апробация результатов диссертации. Апробация работы состоялась на заседании межкафедрального семинара кафедр микробиологии, физиологии человека и животных и биофизики биологического факультета Львовского национального университета имени Ивана Франко 27 июня 2003 Результаты дослижень диссертационной работы, апробированы на следующих конференциях и семинарах: 3rd INTAS Interdisciplinary Symposium "General Biochemistry, Biotechnology and Enviroment "(Moscow, 14-17 December 2000); Отчетная научная конференция сотрудников биологического факультета Львовского Национального университета за 2000-2001 гг. (Львов, февраль 2001); Семинар кафедры микробиологии Львовского Национального университета (Львов, 7 ноября 2001г.) Отчетная научная конференция сотрудников биологического факультета Львовского Национального университета за 2001-2002 гг. (Львов, февраль 2002); Международная научная конференция студентов и молодых ученых "Полет" (Киев, 11-12 апреля 2002) Биология наука ХХI века: 6-я Пущинская школа-конференция молодых ученых (Пущино, 20-24 мая 2002г.) 4-th Parnas Conference "Molecular mechanisms of cell activation: biological signals and their target enzymes" (Wroclaw (Poland), 15-17 September 2002); Отчетная научная конференция сотрудников биологического факультета Львовского Национального университета за 2002-2003 гг. (Львов, февраль 2003); II Международная научно-практическая конференция "Ресурсы природных вод Карпатского региона / Проблемы охраны и рационального использования /" (Львов, 15-16 мая 2003); Internetional Weigl Conference "Microorganisms in pathogenesis and drug resitance" (Lviv, 11-14 September 2003).

Публикации. Результаты дослижень изложены в 11 печатных трудах: в 6 статьях научных журналов и в 5 тезисах конференций.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материалов и методов исследований, раздела с изложением результатов экспериментальных исследований и их обсуждением, заключения и списка использованной литературы, состоящий из 148 наименований. Полный объем диссертационной работы составляет 135 страниц. Работа иллюстрирована 5 таблицами и 39 рисунками.

Основное содержание работы

Обзор литературы. Приведены данные о систематическом положении и общая характеристика видов дрожжей рода Candida. Охарактеризованы метаболизм ряда углеродных соединений у дрожжей: метаболизм лактозы, этанола, этиламина, олеата, углеводородов, в частема, н-алканов, ароматических соединений, нафтенов. Проанализированы и систематизированы научные данные о регуляции метаболизма углеродных соединений у дрожжей: индукцию и репрессию синтеза ферментов, катаболитну регуляцию, в частности, глюкозно катаболитну репрессию, эффект аммония и катаболитну инактивацию. Освещены данные об участии микротилець дрожжей в метаболизме углеродных соединений, регуляцию их гомеостаза: биогенез пероксисом, глюкозно катаболитну репрессию образования микротилець, деградацию пероксисом. Проанализированы данные о роли дрожжей рода Candida в процессах биодеструкции н-алканов, ароматических и циклических углеводородов нефти, актуальность проблемы нефтяных загрязнений, поиск штаммов-деструкторов компонентов нефти.

Материалы и методы. Описаны о Объект исследования, среды культивирования и условия выращивания дрожжей, ряд методов, использованных в экспериментах для достижения цели работы.

Условия выращивания дрожжей и состав сред отличались в экспериментах. Во время исследования биогенеза, деградации и катаболитнои репрессии образования микротилець во время роста в среде с лактозой, биогенеза и деградации пероксисом во время усвоения этанола дрожжи C. kefir ВКМ В-209 выращивали в среде Беркгольдера с добавлением 2% лактозы или 1% этанола. Для создания аэробных условий культуру выращивали в 150 мл среды в Колба Эрленмейера о объемом 500 мл и аерувалы на качалке (200 об. / Мин) при 30С. Для достижения условиях дефицита кислорода клетки выращивали в почти полностью заполненных средой колбах и не аерувалы.

В опытах по изучении способности утилизации этиламина дрожжами C. kefir ВКМ В-209 и образования микротилець во время усвоения этого субстрата среду культивирования не содержало источников азота (сульфата аммония, дрожжевого экстракта). К среде добавляли 1% глюкозу или не вносили ее вовсе. Стерильный этиламин вносили после автоклавирования среды в диапазоне концентраций от 0 до 3%.

В экспериментах по изучении утилизации олеата и биогенезапероксисом при усвоении этого соединения клетки выращивали в среде Беркгольдера, к которому добавляли 0,1% глюкозу или не вносили ее вовсе. После автоклавирования к среде добавляли стерильный олеат в диапазоне концентраций от 0 до 3%. Стерилизация олеата осуществлялась через бактериальный фильтр.

Для определения активности аминооксидазы инкубированных клеток с этиламин, получали суточный инокулят после культивирования клеток в жидкой среде YЕPD при 30С на круговой качалке. Клетки дважды стерильно отмывали дистиллированной водой, осаждали центрифугированием при 3000 об. / Мин в течение 10 мин, переносили в среду Беркгольдера с этиламин с глюкозой или без глюкозы и инкубировали в течение 18 ч при 30 ° С на круговой качалке.

В опытах по изучении биодеструкции углеводородов нефти, а также биогенеза пероксисом при утилизации этого субстрата клетки дрожжей выращивали в среде Беркгольдера, после стерилизации которого добавляли неочищенную нефть с Старосамборской скважины № 8 Страшевицкой месторождения в диапазоне концентраций от 0 до 20%. В качестве эмульгатора использовали Твин 80 в соотношении к нефти 1:12.

Клетки культивировали в условиях аэрации на круговой качалке (200 об. / Мин) при 30С, кроме указанных опытов, которые проводились в условиях низкого обеспечения клеток кислородом.

Биомассу клеток определяли фотоелектроколориметричним и весовым методом (при определении роста дрожжей в среде с нефтью). Для определения процента выживания клетки во время утилизации лактозы отбирали через определенные промежутки времени и высевали из расчета 100 колоний на чашку на среду с лактозой. Электронно исследования клетки дрожжей проводились как описано [Reynolds, 1963]. Просмотр и фотографирование образцов проводили на

Загрузка...

Страницы: 1 2 3






Ещё Рефераты по вашей теме

Экспериментально - биомеханическое обоснование использования углеродных имплантатов для лечения переломов длинных костей у пациентов пожилого возраста - Автореферат
ПЕРИОДИКА УКРАИНЫ КАК ОБЪЕКТ источниковедческую ИССЛЕДОВАНИЯ УКРАИНСКОЙ КУЛЬТУРЫ (1917-1920 гг.) - Автореферат
Клинико-патогенетическая взаимосвязь и лечение хронического бронхита, совмещенного с ишемической болезнью сердца - Автореферат
Морально-этические воззрения УКРАИНСКОГО НАРОДА ЗА Фольклорные источники: аксиологический аспект - Автореферат
СИСТЕМА деривационного СРЕДСТВ СОВРЕМЕННОЙ НАУЧНО-ТЕХНИЧЕСКОЙ терминологии (когнитивно-номинативный аспект) - Автореферат
СМЕШАННЫЕ заразных болезней расплода медоносных пчел (эпизоотология, дифференциальная диагностика, комплексная система мер борьбы и профилактики) - Автореферат
ГОСУДАРСТВЕННОЕ УПРАВЛЕНИЕ рекламной деятельностью в УКРАИНЕ (теоретико-методологические аспекты) - Автореферат