Реферат на тему:


Воспользуйтесь поиском к примеру Реферат        Грубый поиск Точный поиск






Загрузка...
11 - глутамин, 12 - глицин, 13 - глутаминовая кислота, 14 аспарагин

Реферат на тему:

"Гель-электрофорез"

Гель-электрофорез.

Лучший эффект разделения органических макромолекул достигают с помощью гель-электрофореза. В качестве носителя используют гели с крахмала, агарозы, полиакриламида и агарозы - акриламида. Высокое разрешение гель-носителей объясняют эффектом «молекулярного сита». Это связано с пониженной диффузией частиц образца в сетке геля и распределительной действием гель-проникающей хроматографии. Структурно гели состоят из хаотично переплетиних полимерных цепей утворують ситоподибну структуру по всему объему геля. Принцип действия молекулярного сита состоит в том, что крупные молекулы будут движутся тем медленнее, чем меньше времени в структуре геля, размеры которых определяются числом поперечных сшивок между полимерными цепями.

Наиболее эффективными гель-носиемы считают полиариламидни гели, которые сочетают в себе советов свойств:

1. Размер пор может колебаться в широких пределах.

2. Гели можно формировать в калибровочных контейнерах (трубках и пластинах).

3. Они характеризуются очень низким уровнем адсорбции и электроосмоса.

4. Их можно применять с разными буферами.

5. Процесс разделения проходит очень быстро.

6. Разделенные вещества можно определять с помощью денситометра. Полиакриламидные гели получают при спивполимеризации акриламида и метилен акриламида в присутствии системы свободнорадикальных катализаторов. Мономеры растворяют в буфере, добавляют катализатор и приготовленную смесь заливают в соответствующие контейнере, в которых будут проводить электрофорез. Процесс полимеризации (образование геля) при необходимости ускоряют, озаряя контейнеры ультрафиолетом. Изменяя в буфере концентрацию акриламида от 3 до 30% можно получать гели с диаметром пор от 0,2 до 0,5 нм и таким образом регулировать эффект молекулярного сита.

Электрофорез в полиакриламидном геле проводят или в колонках (Мал.2.5.5.) или на пластинах геля (Мал.2.5.6). Колонку с полимерных гелем пидеднюють к камерам, которые

Рис. 2.5.5

А В

Прибор для гель-электрофореза на пластинах.

А-вид спереди В - вид сбоку 1 - пластина с гелем

2 - буферные камеры, 3 - образец, 4 - электроды.

Рис .. 2.5.6.

заполняют соответствующим буфером. Суспензию образца в насыщенном растворе сахарозы с помощью микропипетки наносят на поверхность геля и подают напряжение. После окончания электрофореза столбики геля получают из колонок и закрашивают соответствующим красителем для выявления зон (пятен) разделенных компонентов образца (Мал.2.5.7). Для количественного анализа веществ образца используют в основном два методические подходы.

Мал.2.5.7.

В первом случае, вырезают соответствующие участки геля и экстрагируют из него вещества соответствующим растворителем, после чего определяют их количество спектрофотометрически, флюориметрично или другими инструментальными методами.В втором случае, стобчикы носителя сканируют денситометром. Этот прибор измеряет интенсивность света, проходящего через столбик носителя при перемещении его перпендикулярно светового пучка. Количество света, прошедшего через гелеобразную среду, регистрируется датчиком денситометра. Причем, чем больше концентрация окрашенной вещества, тем меньше света попадает на дитектор денситометра. Если сигнал с денситометра посылать на самопишущие устройство (или цифровой компьютерный анализатор), то можно получить серию пиков (денситограму), которые будут характеризовать место розположення зон на столбцы и количество вещества в них.

Специальные электрофоретической методы.

Диск-электрофорез.

Диск-электрофорез является видоизмененным гель-электрофорезом на вертикальных колонках в полиакриламиде. Этот метод электрофореза был разработан для высококачественного разделения фракций белковых препаратов. Особенность метода состоит в том, что:

1. В электрофоретической колонке используют гели с различным размером пор. Верхний слой геля, который занимает треть колонки, является крупно пористым и его называют концентрационным гелем. В нижней части колонки формируют мелко пористый гель, который собственно является рабочим гелем. Такой градиент размеров пор дает возможность эффективно использовать в процессе разделения явления молекулярного сита.

2. Для диск-электрофореза подбирают такие буферные системы, ионизируя белковые молекулы превращают их в анионы. Поэтому для подачи напряжения в верхней буферной камере размещают катод, а в нижней - анод (Мал.2.5.8.). Электрофорез проводят при постоянной величине электрического тока в пределах 10 мА.

3. В верхней и нижний буферных камерах используют буферные системы с различным значением рН. В нижней буферной камере величина рН на 2-3 единицы выше, чем в верхней. Это приводит к возникновению градиента рН вдоль электрофоретической колонки и сопровождается разной степенью ионизации белковых молекул в концентрационном и рабочем гели.

электрофоретической колонку, заполненную рабочим и концентрационным гелями, помещают в нижнюю камеру с буферной системой трис-глицина. На поверхность геля наносят микропипеткой образец и наполняют буферной системой трис-HCl верхнюю камеру. Прибор закрывают крышкой и подают напряжение на электроды.

Загрузка...